Tóm Tắt – Qua kết quả điều tra, khảo sát tình hình sâu, bệnh tại các vườn ươm ở Phú Thọ năm 2017 và 2018, ghi nhận bệnh héo rũ gây chết hàng loạt cây hom Bạch đàn urô.
Kết quả nghiên cứu xác định được đặc điểm hình thái, triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh héo rũ cây hom Bạch đàn urô trong giai đoạn vườn ươm ở tỉnh Phú Thọ. Triệu chứng điển hình là trên thân bị các vết loét, thâm và lõm ở vỏ cây, lá bị héo. Kết quả phân lập và thí nghiệm gây bệnh nhân tạo trên cây con của 20 chủng nấm: Gây bệnh rất mạnh (01 chủng); gây bệnh mạnh (04 chủng); gây bệnh trung bình (03 chủng); gây bệnh yếu (12 chủng). Các chủng nấm được mô tả có đặc điểm: Thể quả hình cầu màu nâu đen, bào tử vô tính hình hạt gạo hơi cong có kích thước 25-35 x 5-9µm. Định danh chủng nấm gây bệnh rất mạnh (VU6.1) bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 để định loại, so với trình tự tham chiếu JQ411335 xác định chủng nấm VU6.1 thuộc chi Eutypella, họ Diatrypaceae, bộ Xylariales, lớp Ascomycetes.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch đàn là loài cây trồng lấy gỗ, thích nghi với nhiều điều kiện lập địa, chính vì thế bạch đàn đang là một trong những loài cây trồng rừng chính ở Việt Nam. Tính đến năm 2015 diện tích rừng trồng bạch đàn tại Việt Nam khoảng 350.000 ha (Phạm Quang Thu, 2016), với 3 loài bạch đàn được trồng phổ biến là: Bạch đàn lai, Bạch đàn urô và Bạch đàn camal. Sau nhiều thập kỷ phát triển nhanh chóng các loài bạch đàn tại Việt Nam, cuối những năm 1980 tại các tỉnh miền Trung và Đông Nam bộ đã xuất hiện những dịch bệnh chủ yếu là cháy lá và khô lá gây hậu quả nghiêm trọng rừng trồng (Old et al., 2002).
Nấm Cylindrocladium quinqueseptatum và Cryptosporiopsis eucalypti là những tác nhân chính gây bệnh đốm lá và khô cành ngọn bạch đàn tại Việt Nam (Phạm Quang Thu, 2016).Nấm C.eucalypti có nguồn gốc ở vùng ôn đới gây hại cho các loài cây gỗ như cây phong, cây phỉ và cây ăn quả, gây bệnh đốm lá các loài bạch đàn, gây hại nghiêm trọng rừng trồng Bạch đàn camal tại Việt Nam và Thái Lan (Himamanet al., 2016; Old et al., 2002), gây hại bạch đàn tại Brazil (Ferreiraet al., 1998). Ở Việt Nam, nấm C. eucalypti được đánh giá là một trong những loài nấm bệnh gây hại nguy hiểm nhất đối với rừng trồng bạch đàn (Old et al., 2002).
Bệnh cháy lá và khô lá hiện nay đã xuất hiện hầu hết tại các diện tích trồng rừng bạch đàn làm ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây. Nấm Ceratocystis sp. gây bệnh chết héo trên Bạch đàn urô và Bạch đàn camal ở Việt Nam (Nguyễn Minh Chí và Phạm Quang Thu, 2016). Bệnh đốm lá, loét thân gây hại cây con bạch đàn (Nông Phương Nhunget al., 2018).
Bài báo trình bày kết quả điều tra thu mẫu, giám định, đặc điểm hiển vi của nấm gây bệnh héo rũ cây hom Bạch đàn urô ở Phú Thọ.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
a. Vật liệu nghiên cứu
Cây con Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) tại Phú Thọ; các mẫu bệnh héo rũ cây con thu được từ vườn ươm hom Bạch đàn urô.
b. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp xác định triệu chứng của bệnh héo rũ cây con bạch đàn:
Quan sát cây và lá bị héo rũ, kiểm tra trên thân cây bị héo để xác định vết loét và đặc điểm của các vết loét. Mô tả sự đổi màu của vỏ cây ở vết loét và xung quanh vết loét. Mô tả mức độ tổn thương của vỏ ở vết loét và mô tả đặc điểm tán lá của những cây bị bệnh.
Phương pháp gây bệnh nhân tạo: Gây bệnh nhân tạo trên lá được thực hiện theo phương pháp của Nông Phương Nhung và cộng sự (2018): Đục một miếng môi trường đường kính 0,5 cm có chứa sợi nấm đặt vào một điểm ở giữa lá. Thí nghiệm lây bệnh cho 30 lá/dòng, để các lá đã nhiễm nấm vào túi nilon, bảo quản ở 25oC. Sau 15 ngày đo diện tích vết bệnh trên lá.
Căn cứ vào diện tích lá bị bệnh, phân cấp khả năng gây bệnh thông qua diện tích vết bệnh trên lá (S) với 5 cấp, cụ thể như sau: S = 0 cm2 (không gây bệnh), S ≤ 5 cm2 (gây bệnh yếu), 5 cm2 < S ≤ 10 cm2 (gây bệnh trung bình), 10 cm2 < S ≤ 15 cm2 (gây bệnh mạnh), S > 15 cm2 (gây bệnh rất mạnh).
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái: Mô tả đặc điểm hình thái các giai đoạn phát triển của các mẫu nấm gây bệnh. Mô tả các dạng bào tử của nấm trên kính hiển vi quang học Olympus BX50.
Phương pháp định loại nấm gây bệnh bằng chỉ thị phân tử: Tách ADN: Sinh khối được chia nhỏ và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml đã bổ sung 500 µl 2xSSC. Lắc đều và ủ ở 99°C trong 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nước cất vô trùng. Thêm 100 µl hạt thủy tinh có đường kính 0,2 – 0,5 mm (Roth, Đức), 100 µl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 µl nước cất vô trùng. Lắc ở 1.400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20°C.
Phân đoạn rADN được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), trên thiết bị C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94°C trong 3 phút kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72°C trong 10 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10°C. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được phân tích trình tự tại hãng 1st BASE (Malaysia). Các chuỗi ADN được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide. Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit. Việc giám định được thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm.
Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm GenStat 12.1 để phân tích sự sai khác về các chỉ tiêu thống kê.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
a. Triệu chứng của bệnh héo rũ cây hom Bạch đàn urô
Triệu chứng điển hình của bệnh héo rũ trên cây hom Bạch đàn urô ở giai đoạn vườn ươm là trên thân cây bị bệnh có những vết loét, thâm hoặc vết lõm ở phần vỏ cây. Vỏ ở xung quanh vị trí vết bệnh thường bị đổi màu nâu đen (Hình 1c). Những cây bị bệnh thường có hiện tượng héo lá từ trên ngọn xuống, nguyên nhân là do nấm sinh trưởng phát triển trên thân, gây loét, làm chết hoàn toàn phần thân bị bệnh, cây không dẫn được nước để nuôi tán, lá bị héo và sau đó làm cây chết. Bệnh héo rũ gây hại trên cây bạch đàn trong suốt giai đoạn gieo ươm nhưng khi cây còn non rất rễ nhầm với bệnh thối cổ rễ hoặc thối nhũn (Hình 1b), bệnh biểu hiện rõ ở giai đoạn 3 tháng tuổi đến khi xuất vườn.
b. Tính gây bệnh
Từ các mẫu cây con bị bệnh héo rũ đã phân lập và thuần khiết được 20 chủng nấm. Kết quả kiểm tra tính gây bệnh thông qua gây bệnh nhân tạo trên lá sau 15 ngày đã xác định được mức độ gây bệnh của các chủng nấm, kết quả gây bệnh nhân tạo trên lá được tổng hợp trong bảng 1.
Kết quả tổng hợp cho thấy, 20 chủng nấm và đối chứng (ĐC) có khả năng gây bệnh rất khác nhau và được chia thành các nhóm gồm: Không gây bệnh (đối chứng PDA), gây bệnh yếu (12 chủng), gây bệnh trung bình (3 chủng: VU4.2; VU4.3; VU6.4), gây bệnh mạnh (4 chủng: VU6.3; VU6.2; VU6.5; VU6.6) và 1 chủng gây bệnh rất mạnh (VU6.1).
c. Đặc điểm hình thái các chủng nấm
Đặc điểm hiển vi của các chủng nấm khi quan sát trên kính hiển vi quang học: Thể quả hình cầu hoặc gần cầu, màu nâu đen và xuất hiện nhiều trên các vết bệnh, chúng chủ yếu nằm sâu trong phần mô của vỏ, lá, nhưng có trường hợp thể quả nổi ngay trên bề mặt và có thể quan sát được bằng kính lúp khi đi điều tra ngoài hiện trường. Bào tử vô tính hình hạt gạo hơi cong, không màu hoặc màu vàng nhạt (Hình 3), hai đầu tròn, dài từ 25-35 µm, rộng từ 5-9 µm.
d. Kết quả định danh bằng chỉ thị phân tử
Trình tự đoạn gen ITS của chủng nấm gây bệnh rất mạnh VU6.1 được so sánh với các trình tự tham chiếu thuộc chi Eutypella được tải về từ cơ sở dữ liệu ngân hàng gen (NCBI GenBank). Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự khác biệt trong trình tự ITS sử dụng phần mềm MEGA 7 (Hình 4). Giá trị bootstrap bằng hoặc lớn hơn 50% thu nhận từ 1.000 lần gieo được thể hiện. Mã số GenBank của các trình tự được đưa ra sau tên loài và chủng. Thanh chèn tương ứng 2% khác biệt trình tự tương ứng.
Đoạn gen ITS của chủng nấm gây bệnh được so sánh với các trình tự tham chiếu từ ngân hàng gen đã xác định được chủng nấm VU6.1 tương đồng 99,7% với chi Eutypella, họ Diatrypaceae, bộ Xylariales, lớp Ascomycetes (Hình 4).
4. THẢO LUẬN
Các chủng nấm gây bệnh héo rũ bạch đàn có đặc điểm hình thái tương đồng với chi nấm Eutypella, có bào tử hình cầu hoặc gần cầu, thể quả hình cầu màu nâu đen, bào tử vô tính hình hạt gạo hơi cong, không màu hoặc màu vàng nhạt, hai đầu tròn, dài từ 25-35 µm, rộng từ 5-9 µm. Sáu loài thuộc chi Eutypella cũng đã được mô tả tại vườn quốc gia Great Smoky Mountains của Mỹ, đặc điểm chung của 6 loài này là bào tử hình cầu hoặc gần cầu, thể quả màu nâu đen, bào tử vô tính và bào tử nang của 6 loài nấm được mô tả có sự khác biệt: Eutypella cerviculata trên cây bạch dương có kích thước túi bào tử 30-40 x 5-7 μm, bào tử nang dài 6-7 μm; Eutypella fraxinicola trên loài Fraxinus sp. có kích thước bào tử 30-35 x 6-8 μm, bào tử nang 8-10 x 1.5-2 μm; Eutypella leaiana trên cây Carpinus caroliniana có kích thước túi bào tử 30-40 x 5-7 μm, bào tử nang dài 6-7 μm; Eutypella leprosa trên một số loài cây rụng lá có kích thước bào tử 30-50 x 6-9 μm, bào tử nang (8)10-14(16) × 2.5-3(4) μm; Eutypella scoparia trên cây Robinia pseudoacacia có kích thước bào tử 14-17 x 4-4.5 μm, bào tử nang dài 3-4 μm; Eutypella vitis trên thân cây nho dại có kích thước bào tử 30-40 x 6-8 μm, bào tử nang 10-14 x 2-2.5 μm. Nấm E. australiensis được mô tả có kích thước bào tử 40-50 × 7-8.5 μm, bào tử nang (16)18-22(25) × 1-1.5 µm.
Khuếch đại đoạn rADN bằng cách sử dụng cặp mồi ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) đã được sử dụng để định danh nấm Eutypella australiensis gây chết cây Keo longifolia tại Úc, nấm E. australiensis là một loài mới thuộc chi Eutypella, nấm Eutypella microtheca gây suy giảm năng suất cây nho tại Mexico. So sánh trình tự đoạn gen ITS của chủng VU6.1 với trình tự tham chiếu JQ41133522 đã xác định chủng nấm VU6.1 thuộc chi Eutypella, đây cũng là loài nấm có trong bọt biển tại Caribe, Thái Bình Dương và Panama.
Một số loài thuộc chi Eutypella đã được ghi nhận gây bệnh cho thực vật như: Nấm Eutypella parasitica gây hại cây phong có nguồn gốc ở Bắc Mỹ, lần đâu tiên ghi nhận ở Slovenia năm 2005, gây chết cây phong tại rừng ở Áo năm 2006, ở Croatia năm 2007, tại Đức và Hungary năm 2016; nấm Eutypella pseudostromatica gây hại trên cây Chengeltheri tại Ấn Độ. Chủng nấm VU6.1 được xác định là nấm Eutypella sp. lần đầu tiên ghi nhận gây chết cây hom Bạch đàn urô tại Phú Thọ, đây là sinh vật gây bệnh nguy hiểm cho vườn ươm và rừng trồng vì thế cần có các nghiên cứu quản lý dịch bệnh phù hợp.
5. KẾT LUẬN
Xác định được triệu chứng của bệnh héo rũ: Trên thân cây bị bệnh có những vết loét, thâm hoặc vết lõm ở phần vỏ cây. Những cây bị bệnh thường có hiện tượng héo lá từ trên ngọn xuống, có thể làm cây chết.
Phân lập và thuần khiết được 20 chủng nấm gây bệnh héo rũ, tính gây bệnh của 20 chủng nấm rất khác nhau và được chia thành 4 nhóm gồm: Gây bệnh rất mạnh (VU6.1), gây bệnh mạnh (VU6.3; VU6.2; VU6.5; VU6.6), gây bệnh trung bình (VU4.2; VU4.3; VU6.4), 12 chủng còn lại gây bệnh yếu.
Xác định được đặc điểm hình thái của nấm: Bào tử hình cầu hoặc gần cầu màu đen, bào tử vô tính hình hạt gạo hơi cong, không màu hoặc màu vàng nhạt, kích thước bào tử vô tính từ 25-35 x 5-9 µm.
Chủng nấm VU6.1 gây bệnh héo rũ gây chết cây Bạch đàn urô ở giai đoạn vườn ươm tại Phú Thọ được xác định là nấmEutypella sp., đây là đối tượng lần đầu tiên ghi nhận gây hại trên cây hom Bạch đàn urô tại Việt Nam.
| TÀI LIỆU THAM KHẢO
1) Ananthapadmanaban, D., 1989. Eutypella pseudostromatica sp. nov. from India. Mycological research, 92(3), pp. 378-379. 2) Bolaños, J., De León, L.F., Ochoa, E., Darias, J., Raja, H.A., Shearer, C.A., Miller, A.N., Vanderheyden, P., Porras-Alfaro, A., Caballero-George, C., 2015. Phylogenetic Diversity of Sponge-Associated Fungi from the Caribbean and the Pacific of Panama and Their In Vitro Effect on Angiotensin and Endothelin Receptors. Marine biotechnology, 17(5), pp. 533-564. 3) Nguyễn Minh Chí và Phạm Quang Thu, 2016. Bệnh chết héo bạch đàn tại Việt Nam, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, (6), tr. 119-123. 4) Ferreira, F., Silveira, S., Alfenas, A. and Demuner, A., 1998. Eucalyptus leaf spot in Brazil caused by Cryptosporiopsis eucalypti. Fitopatologia Brasileira, 23 (3). 5) Hall, T.A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser, (41), pp. 95-98. 6) Himaman, W., Thamchaipenet, A., Pathom-aree, W. and Duangmal, K., 2016. Actinomycetes from Eucalyptus and their biological activities for controlling Eucalyptus leaf and shoot blight. Microbiological research, (188), pp. 42-52. 7) Ivić, D., Sever, Z. and Tomić, Ž., 2017. First Record of Eutypella parasitica on Maples in Urban Area in Croatia. South-east European forestry, 8 (1), pp. 47-50. 8) Nông Phương Nhung, Đặng Thị Kim Anh, Trần Xuân Hinh, Nguyễn Minh Chí, 2018. Bệnh đốm lá, loét thân bạch đàn ở giai đoạn vườn ươm, Tạp chí khoa học Lâm nghiệp, (1), tr. 75-82. 9) Old, K., Dudzinski, M., Pongpanich, K., Yuan, Z., Quang, T.P. and Tran, N.N., 2002. Cryptosporiopsis leaf spot and shoot blight of eucalypts. Australasian Plant Pathology, 31 (4), pp. 337-344. 10) Paolinelli-Alfonso, M., Serrano-Gomez, C., Hernandez-Martinez, R., 2015. Occurrence of Eutypella microtheca in grapevine cankers in Mexico. Phytopathologia Mediterranea, 54 (1), pp. 86-93. 11) Phạm Quang Thu, 2016. Kết quả nghiên cứu thành phần sâu, bệnh hại một số loài cây trồng rừng chính tại Việt Nam, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, (1), tr. 4257-4264. 12) Trouillas, F.P., Sosnowski, M.R., Gubler, W.D., 2010. Two new species of Diatrypaceae from coastal wattle in Coorong National Park, South Australia. Mycosphere, 1(2), pp. 183-188. 13) Vasilyeva, L.N., Stephenson, S.L., 2006. Pyrenomycetes of the Great Smoky Mountains National Park. III. Cryptosphaeria, Eutypa and Eutypella (Diatrypaceae). Fungal Diversity, (22), pp. 243-254. |
Trần Xuân Hinh – Nguyễn Văn Nam – Dương Xuân Tuấn (Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam)
Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Quang
Ngày nhận bài: Tháng 7/2018
Ngày phản biện thông qua: Tháng 7/2018
Ngày duyệt đăng: Tháng 8/2018
